Introduction

W niniejszej propozycji projektu badawczego planujemy mechanistyczne modelowanie matematyczne i badania  eksperymentalne w celu wyjaśnienia na jakiej drodze promieniowanie jonizujące wpływa na oddziaływania pomiędzy różnymi typami komórkowego RNA, w szczególności między regulatorowymi micro-RNA i mRNA, oraz na ekspresję genów w komórkach poddanych jego działaniu. Oryginalna hipoteza  badawcza tego projektu zakłada, że główny wpływ promieniowania odbywa się za pośrednictwem indukcji reaktywnych form tlenu, które modyfikują cząsteczki RNA uczestniczące w mechanizmie interferencji RNA, chociaż inne drogi powstawania modyfikacji są również możliwe i będą badane. Proces nazywany interferencją RNA, jest komórkowym mechanizmem regulacji ekspresji genów, w którym następuje inhibicja translacji lub degradacja mRNA. Opiera się na specyficznym oddziaływaniu cząsteczek mRNA z regulatorowymi cząsteczkami RNA (micro-RNA). Micro-RNA, tworząc z białkami z rodziny Argonaute kompleks RISC, „naprowadza” ten kompleks na właściwe cząsteczki mRNA i hamuje ich ekspresję poprzez blokowanie translacji albo poprzez indukcję degradacji mRNA. Promieniowanie jonizujące indukuje radiolizę wody i powstawanie reaktywnych form tlenu, które modyfikują strukturę różnych makrocząsteczek komórkowych w tym także RNA. Oksydacyjne zmiany struktury RNA mogą zmieniać tworzenie kompleksów micro-RNA-mRNA lub zmieniać strukturę pre-miRNA i tą drogą wpływać na tworzenie kompleksu RISC. W naszych dotychczasowych badaniach po zadziałaniu promieniowania obserwowaliśmy wzrost poziomu wielu mRNA posiadających miejsca wiązania dla miRNA. RNA jest modyfikowany przez czynniki oksydujące w wyższym stopniu niż DNA, a modyfikacje nawet pojedynczego nukleotydu mogą zmieniać energię wiązania we fragmentach podwójnoniciowych cząsteczek RNA. Tak więc oksydacyjne modyfikacje RNA zmieniające komplementarność nukleotydów mogą potencjalnie modulować mechanizm interferencji. Głównym celem niniejszego projektu jest zbadanie jaki wpływ na oddziaływanie mRNA-miRNA i tworzenie kompleksu RISC ma promieniowanie i wewnątrzkomórkowy poziom ROS. Ponieważ wpływ na oddziaływanie mRNA-miRNA i tworzenie kompleksu RISC mają również modyfikacje RNA wprowadzane enzymatycznie przez deaminazę adenozynową – ADAR, planujemy także zbadanie czy promieniowanie jonizujące wpływa na działanie ADAR i poziom modyfikacji wprowadzanych przez ten enzym. Na rycinie 1 przedstawiamy uproszczony schemat działania głównych elementów mechanizmu interferencji RNA z udziałem miRNA i kompleksu RISC i możliwy wpływ modyfikacji RNA, który chcemy badać. Badania będą możliwe dzięki naszemu interdyscyplinarnemu zespołowi, który ma doświadczenie w łączeniu matematyki, bioinformatyki i eksperymentu biologicznego i jest przygotowany metodologicznie. Planujemy rozwijanie naszego modelu interferencji RNA. Używając narzędzi bioinformatycznych będziemy charakteryzować sekwencje nukleotydowe, które mogą uczestniczyć w modulowaniu interferencji RNA przez reaktywne formy tlenu oraz badać dynamikę procesu. Rolę znalezionych na drodze modelowania micro-RNA i sekwencji regulatorowych będziemy weryfikować w eksperymencie biologicznym używając  genu reporterowego. Planujemy także badanie roli reaktywnych form tlenu przez oznaczanie ich poziomu komórkowego i ich chemiczną indukcję. Zweryfikowany eksperymentalnie model powinien dać możliwość przewidywania zmian w ekspresji genów w napromienianych komórkach co może mieć stworzyć nowe perspektywy dla indywidualizacji terapii przeciwnowotworowych. Przedstawiana w projekcie hipoteza dotycząca roli reaktywnych form tlenu w modulacji ekspresji genów jest nowa i jak sądzimy warta dalszych badań.

Goal

W naszych wcześniejszych badaniach zaobserwowaliśmy, że w komórkach ludzkich poziom ekspresji tysięcy genów zmienia się już kilka minut po potraktowaniu komórek promieniowaniem jonizującym [Herok i wsp., 2010]. Analiza sekwencji wykazała, że w grupie nadekspresjonowanych transkryptów występuje znacząco więcej motywów rozpoznawanych przez miRNA niż w grupie transkryptów o obniżonej ekspresji [Jaksik i wsp., 2014]. Zaobserwowaliśmy również, że kilka minut po napromieniowaniu w komórkach znacząco wzrasta poziom reaktywnych form tlenu (ROS) [Saenko i wsp., 2013]. Biorąc pod uwagę nasze obserwacje oraz fakt, że ROS powodują oksydacyjne uszkodzenia i modyfikacje kwasów nukleinowych [Bregeon i Sarasin, 2005; Wurtmann i Wolin, 2009] a zmiana w strukturze czy sekwencji pre-miRNA w znaczący sposób wpływa na tworzenie kompleksu RISC i interferencję RNA [Khvorova i wsp., 2003; Meister, 2013], postawiliśmy hipotezę badawczą, że modyfikacje cząsteczek RNA indukowane przez ROS są istotnym elementem mechanizmu regulacji ekspresji genów, niezależnym od innych możliwych ścieżek oddziaływań – patrz Ryc.1. Bazując na naszych wcześniejszych doświadczeniach w modelowaniu matematycznym procesów biologicznych oraz prowadzeniu badań eksperymentalnych planujemy zweryfikować powyższą hipotezę badawczą stąd głównym celem niniejszego projektu jest zbadanie jaki wpływ na oddziaływanie mRNA-miRNA i tworzenie kompleksu RISC ma wewnątrzkomórkowy poziom ROS. Ponieważ wpływ na oddziaływanie mRNA-miRNA i tworzenie kompleksu RISC mają również modyfikacje RNA katalizowane przez wewnątrzkomórkowe enzymy (tj. deaminaza adenozynowa – ADAR) [Ota i wsp., 2013], więc celem dodatkowym niniejszego projektu jest zbadanie czy promieniowanie jonizujące wpływa na działanie ADAR.

Tasks

Zadanie 1 Modelowanie procesu interferencji RNA z uwzględnieniem wpływu promieniowania jonizującego Zadanie 2 Bioinformatyczna analiza sekwencji nukleotydowych transkryptów i miRNA uczestniczących w regulacji z udziałem promieniowania jonizującego Zadanie 3 Przeprowadzanie eksperymentów mających na celu estymację parametrów modelu i jego weryfikację

Contractors

Project manager

Marek Kimmel

Contractors

Joanna Rzeszowska, Roman Jaksik, Krzysztof Fujarewicz, Daria Kogut, Patryk Bil, Michał Jakubczak, Karolina Kurasz, Sylwia Ciesielska, Aleksandra Poterała, Marzena Mura, Anna Lalik, Magda Skonieczna, Dorota Hudy

Results

Articles