Glikobiologia, dziedzina biologii zajmującą się badaniem roli cukrów, jest dynamicznie rozwijającym się obszarem wiedzy. Wzrost zainteresowania tą dziedziną wynika przede wszystkim z faktu iż oligosacharydy przyłączone do białek i/lub lipidów wpływają na cały szereg procesów biologicznych w tym na wzrost, metabolizm i szlaki sygnałowe komórki. Glikany znajdujące się na powierzchni komórek biorą również udział w oddziaływaniach międzykomórkowych i odpowiedzi immunologicznej organizmu. Tak wieloraka funkcja oligosacharydów połączona z faktem, że glikozylacja jest procesem bardzo wrażliwym na zmiany wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe sprawia, że motywy cukrowe są często wykorzystywane jako biomarkery charakteryzujące stan fizjologiczny komórek.

Proces glikozylacji jest procesem złożonym, przebiegającym (w odróżnieniu od syntezy kwasów nukleinowych i łańcuchów polipeptydowych) bez matrycy i jest zależna od typu glikozylotransferaz obecnych w komórce, ich stężenia oraz charakterystyki. Z tego powodu poznanie mechanizmów regulujących proces glikozylacji oraz struktur oligosacharydów jest wyraźnie powiązany z rozwojem narzędzi informatycznych.

W ramach niniejszego projektu planowane jest opracowanie aplikacji do predykcji struktur glikanów w oparciu o dane genomiczne oraz aplikacji do badania fluorescencji komórek znakowanych lektynami i określenia przestrzennej dystrybucja lektyn na powierzchni komórek. Dodatkowym efektem niniejszego projektu będzie rozwój nowych metod przetwarzania i analizy fluorescencyjnych obrazów mikroskopowych komórek, w szczególności zaś przetwarzania obrazów o więcej niż jednym spektrum oraz obrazów przedstawiających obiekty niespójne oraz określenie antygenów cukrowych pojawiających się w ludzkich komórkach nowotworowych pod wpływem promieniowania jonizującego.

Opracowane w ramach niniejszego projektu narzędzia przyczynią się do lepszego zrozumienia procesów zachodzących w komórkach oraz będą mogły być wykorzystywane przy skryningu cytologicznym mającym na celu znalezienie markerów cukrowych charakterystycznych dla danego typu komórek czy tkanek. Markery te będą mogły być potencjalnie wykorzystane przy tworzeniu testów diagnostycznych oraz w terapii celowanej. Strona 3 z 20 Wniosek nr

Glikobiologia, dziedzina biologii zajmującą się badaniem roli cukrów, jest dynamicznie rozwijającym się obszarem wiedzy. Wzrost zainteresowania tą dziedziną wynika przede wszystkim z faktu, iż oligosacharydy przyłączone do białek lub lipidów regulują procesy metaboliczne i uczestniczą w odpowiedzi immunologicznej organizmu [Dwek, 1995]. Stwierdzono również, że z jednej strony mutacje uszkadzające geny glikozylotransferaz wywołują choroby (np. wrodzone zaburzenia glikozylacji typu I i II), z drugiej strony stanom patologicznym (takim jak np. reumatoidalne zapalenie stawów, zaćma, nowotwory) towarzyszą charakterystyczne dla danej choroby zmiany we wzorcu glikozylacji [Ohtsubo i Marth, 2006]. W efekcie tych odkryć do głównych obszarów badawczych związanych z glikobiologią należy poszukiwanie powierzchniowych antygenów cukrowych, które będą mogły być wykorzystywane w terapii celowanej lub będą markerami służącymi do identyfikacji komórek zmienionych chorobowo.

Poszukiwanie markerów cukrowych wymaga poznania procesów regulujących biosyntezę danych struktur cukrowych oraz opracowania narzędzi, które pozwolą szybko i precyzyjnie wskazać struktury oligosacharydów charakterystyczne dla danych komórek. Brak takich narzędzi skłonił wnioskodawców do podjęcia próby opracowania w ramach niniejszego projektu metody przewidywania struktur cukrowych w oparciu o dane genomiczne z uwzględnieniem charakterystyki kinetycznej poszczególnych glikozylotransferaz. Na tej podstawie planowane jest opracowanie oprogramowania, które będzie realizować tak postawione zadanie. Opracowanie metody predykcji oraz utworzenie oprogramowania będącego jej implementacją jest głównym celem zgłaszanego projektu. Poprawność działania zdefiniowanego powyżej oprogramowania (a tym samym poprawność opracowanej metodyki) zostanie zweryfikowana poprzez zastosowanie go do predykcji struktur glikanów w wybranych ludzkich liniach komórkowych. Otrzymane tą metodą wyniki zostaną porównane z motywami cukrowymi zidentyfikowanymi eksperymentalnie na powierzchni komórek za pomocą lektyn sprzężonych ze znacznikiem fluorescencyjnym.

Do określenia ilości i rodzaju lektyn występujących na powierzchni znakowanych komórek planowane jest zastosowanie oprócz standardowych urządzeń (tzn. cytofluorymetru przepływowego oraz czytnika mikropłytek) nowego rozwiązania, w którym do analizy obrazów komórek znakowanych lektynami pozyskanych przy zastosowaniu mikroskopu fluorescencyjnego wykorzystane zostaną metody stosowane w widzeniu komputerowym. Opracowanie odpowiedniego algorytmu wspomagającego analizę tak pozyskanych obrazów, a w dalszej kolejności opracowanie oprogramowania będącego jego implementacją, jest drugim z celów badawczych niniejszego projektu.

Aplikacja do przewidywania struktur cukrowych w oparciu o dane genomiczne.

Na podstawie informacji o poziomie ekspresji genów glikozylotransferaz katalizujących specyficzne reakcje prowadzące do powstawania wiązań miedzy jednostkami cukrowymi oraz w oparciu o obszerne bazy danych wyznaczonych eksperymentalnie struktur glikanów [Hashimoto i współ., 2006] możliwe jest wskazanie zestawu struktur powstających z największym prawdopodobieństwem w badanych warunkach doświadczalnych. [Kawano i współ., 2005]. W ramach niniejszego projektu planuje się zbudowanie aplikacji komputerowej do przewidywania struktur glikanów na podstawie danych genomicznych. Zaproponowany przez [Sugo i współ, 2007] algorytm wnioskodawcy zamierzają zmodyfikować tak, by móc wykorzystywać identyfikatory i annotacje mikromacierzowe EntrezGene. Pozwoli to na ominięcie niespecyficznych probsetów Affymetrix wytwarzających dla pojedynczego genu wiele sygnałów o różnym poziomie ekspresji. Ponadto planowane jest umożliwienie wykorzystywania w aplikacji danych genomicznych innego typu niż mikromacierzowe (np. danych uzyskanych techniką Real-Time PCR) oraz dołączenie opcji aktualizacji bazy danych struktur oraz reakcji enzymatycznych, na których metoda jest oparta. Planowane są również badania mające na celu udoskonalenie metody oceny podobieństwa pomiędzy poszczególnymi strukturami, odpowiedni dobór wskaźnika korelacji miedzy zestawem badanych glikotransferaz a budową określonego glikanu oraz włączenie do algorytmu charakterystyki kinetycznej glikozylotransferaz.

Badanie wzorca glikozylacji komórek za pomocą lektyn znakowanych fluorescencyjnie

Badania wzorca glikozylacji prowadzone będą na dwóch ludzkich liniach komórkowych (komórkach białaczki K562 i komórkach czerniaka Me45). Do analizy struktury łańcuchów cukrowych związanych z białkami wykorzystywany będzie zestaw lektyn znakowanych FITC: Fluorescein Lectin Kit (Vector Lab.). Po związaniu lektyn do antygenów cukrowych znajdujących się w komórkach fluorescencja komórek oznaczana będzie za pomocą cytometru przepływowego BD FACSCanto. Fluorescencja próbek (pula komórek znakowanych lektynami) oznaczana będzie w bioluminometrze. Na potrzeby wykorzystania metod widzenia komputerowego do badania fluorescencji komórek znakowanych lektynami i określenia przestrzennej dystrybucja lektyn na powierzchni komórek przygotowane zostaną preparaty mikroskopowe zawierające komórki znakowane lektynami. Preparaty te zostaną znakowane barwnikami FITC (lektyny) i DAPI (jądra komórkowe). Potrzebne do takiej analizy obrazy pozyskane zostaną przy wykorzystaniu mikroskopu fluorescencyjnego firmy Zeiss dla dwóch różnych (wynikających z charakterystyk stosowanych barwników fluorescencyjnych) zakresów światła widzialnego (każdy interesujący fragment preparatu będzie reprezentowany przez parę obrazów). Po wstępnym przetwarzaniu obrazów obejmującym m.in. standardowe operacje redukcji szumu i poprawy kontrastu obrazy zostaną poddane segmentacji połączonej z usuwaniem artefaktów powstałych przy wykonywaniu preparatów. Do segmentacji zostaną wykorzystane autorskie rozwiązania wykorzystujące elementy teorii grafów i ideę rozrostu obszarów. Po zakończeniu tego etapu na każdej parze obrazów wydzielone zostaną obiekty należące do tej samej komórki, co pozwoli na określenie intensywności świecenia lektyn oraz ich rozłożenia przestrzennego powierzchni poszczególnych komórek. Wyniki, które zostaną otrzymane przedstawionymi powyżej trzema metodami (cytofluorymetr przepływy, bioluminometr i metoda obrazowa), wykorzystane zostaną do weryfikacji poprawności działania metod predykcji wzorca glikozylacji, a także pozwolą na wzajemną kontrolę poprawności realizacji pomiarów wspomnianymi metodami. Dzięki takiemu podejściu wydaje się, że możliwość zafałszowania wyników badań poprzez błędy pomiarowe zostanie znacznie ograniczona.

Project manager

Artur Bal

Contractors

Anna Lalik, Artur Bal, Roman Jaksik